Biotecnologie microbiche e ambientali:

 
 
 
Biotecnologie microbiche e ambientali
di Domenico Azarnia Tehran
 
Appunti relativi all'esame di biotecnologie. Si trattano approfonditamente la
struttura cellulare, in particolare la membrana citoplasmatica, e i principali
microorganismi responsabili di patologie anche sull'uomo. Descritti numerosi
batteri e archea: la loro patogenicità, la meccanica di contagio della specie
umana ecc. Vengono descritti anche i biocarburanti.
 
Università: Università degli Studi di Roma La Sapienza
Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso: Scienze Biologiche
Esame: Biotecnologie microbiche e ambientali
Docente: Claudio Palleschi1. Introduzione alle biotecnologie microbiche e alla microbiologia
generale
La microbiologia studia le cellule e il loro funzionamento, in particolar modo quelle batteriche che
rappresentano un vasto gruppo di microrganismi di enorme importanza nella scienza di base e in quella
applicata. Inoltre, studia il ruolo di questi microrganismi nel mondo, nella società umana, nel corpo umano e
nelle piante. I microrganismi si distinguono dalle cellule di animali e piante perché quest'ultime sono capaci
di vita propria in natura ed esistono come parti di strutture multicellulari (organi negli animali e componenti
strutturali nelle piante); al contrario la maggior parte dei microrganismi è in grado di effettuare tutti i
processi vitali associati alla crescita, alla generazione dell'energia e alla riproduzione.   
La cellula è l'unità fondamentale della vita. Essa è un identità, isolata dalle altre cellule mediante una
membrana cellulare e contenente una varietà di strutture chimiche e subcellulari. Tutte le cellule sono
strutture altamente organizzate, costituite da almeno quattro componenti chimiche: proteine, acidi nucleici,
lipidi e polisaccaridi che nell'insieme sono chiamate macromolecole. Ciò che rende un organismo diverso
dall'altro risiede fondamentalmente nella natura chimica e nelle modalità organizzative dei componenti
chimici all'interno della cellula. Tutti gli organismi cellulari sono altamente organizzati in strutture che
mostrano una sorta di metabolismo. Ciò significa che le cellule prendono nutrienti dall'ambiente e li
trasformano, conservando parte dell'energia presente in tali sostanze in modo da poterla utilizzare, e poi
eliminano i prodotti di scarto. Tutte si riproducono, cioè sono capaci di dirigere una serie di eventi
biochimici che risultano nella crescita e nella divisione per dare origine a due cellule. Molte cellule si
differenziano, processo durante il quale si formano nuove sostanze o strutture ( come le spore, coinvolte
nella riproduzione, nella disseminazione e nella sopravvivenza). Esse comunicano, rispondono ai segnali
chimici presenti nell'ambiente, compresi quelli prodotti da altre cellule. Inoltre gli organismi viventi sono
capaci di movimento attivo, soprattutto nel mondo microbico. Infine le cellule possono evolvere: attraverso
il processo di evoluzione possono cambiare permanentemente le loro caratteristiche e trasmettere alla
progenie le nuove proprietà. Le cellule in realtà sono sia delle macchine chimiche in grado di operare
trasformazioni all'interno della struttura cellulare stessa, grazie anche agli enzimi che accelerano le reazioni
chimiche, sia strumenti codificanti che immagazzinano e processano l'informazione genetica (DNA) che
possono essere passate alla progenie durante il processo riproduttivo. Le cellule vivono in natura in
associazione con altre cellule in una sorta di agglomerato chiamato popolazione. Le popolazioni sono quindi
costituite da gruppi di cellule correlate, generalmente derivate da una singola cellula per successive divisioni
cellulari. Il luogo dove la popolazione microbica vive si chiama habitat. In natura raramente le popolazioni
vivono isolate; piuttosto esse vivono e interagiscono con altre popolazioni cellulari assemblate nelle
cosiddette comunità microbiche. Lo studio dei microrganismi nel loro habitat naturale si chiama ecologia
microbica. Quando parliamo di organismi viventi insieme alle caratteristiche chimico-fisiche del loro
ambiente, stiamo parlando di ecosistema. I maggiori ecosistemi microbici sono quelli acquatici (oceani,
laghi, stagni etc.), terrestri ( suolo e sottosuolo profondo) e quelli degli organismi superiori, siano essi
animali o piante. Per questo le proprietà di un ecosistema sono spesso sotto il controllo dannoso e/o benefico
di attività microbiche. I microrganismi rimuovono attraverso processi metabolici nutrienti dall'ambiente e li
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Biotecnologie microbiche e ambientali usano per costruire nuove cellule. Contemporaneamente però eliminano prodotti di scarto nell'ambiente.
L'esame di ambienti naturali come il suolo e l'acqua rilevano la presenza di cellule microbiche e benché
cellule così piccole possano sembrare poco importanti, esse sono capaci di moltiplicarsi rapidamente e
produrre popolazioni molto numerose con effetti importanti sugli habitat stessi. I microrganismi sono quindi
estremamente importanti e parte significativa di ogni ecosistema. Valutazioni accurate del numero totale di
cellule microbiche sulla terra, specificamente dei procarioti (batteri), indicano un numero di 5x10*30
cellule. L'ammontare complessivo di carbonio presente in questo enorme numero di piccolissime cellule
eguaglia quello di tutte le piante del pianeta, mentre il contenuto di azoto e fosforo è 10 volte superiore.
Inoltre i microrganismi costituiscono la maggior quota di biomassa presente sulla terra. 
 
LA COLORAZIONE BATTERICA 
Le colorazioni differenziali sono così chiamate perché non colorano in maniera uguale tutti i tipi di cellule.
Un importante colorazione differenziale, ampiamente utilizzata in batteriologia, è la colorazione di Gram.
Sulla base di questa colorazione i batteri possono essere suddivisi in due grandi gruppi: Gram-positivi e
Gram-negativi. I batteri Gram-positivi si presentano colorati in viola, mentre quelli Gram-negativi in rosso.
La diversa reazione alla colorazione di Gram è dovuta alle differenze strutturali nella parete cellulare.
L'etanolo è in grado di decolorare un batterio Gram-negativo, ma non un Gram-positivo.  
 
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Biotecnologie microbiche e ambientali 2. La membrana citoplasmatica: struttura 
La membrana citoplasmatica è una struttura sottile che circonda completamente la cellula. Spessa soltanto 8
nm, questa struttura d'importanza vitale è la barriera che separa l'interno della cellula (il citoplasma)
dall'ambiente. La struttura generale delle membrane biologiche è un doppio strato fosfolipidico. Dal
momento che i fosfolipidi in soluzione acquosa si aggregano, essi tendono a formare spontaneamente
strutture a doppio strato, con gli acidi grassi rivolti all'interno a costituire un ambiente idrofobico mentre le
porzioni idrofiliche rimangono esposte verso il mezzo esterno acquoso. Lo strato fosfolipidico può essere
separato, per studiare la localizzazione delle proteine di membrana e per osservare sottili sezioni, mediante
esperimenti di criodecapaggio. In questo modo essa appare composta da due linee chiare separata sa un'area
piuttosto scura. Questa membrana unitaria, così chiamata perché ogni strato fosfolipidico forma metà
dell'”unità”, consiste di un doppio strato fosfolipidico, nel quale sono immerse molecole proteiche. Le
principali proteine della membrana cellulare hanno in genere superfici esterne altamente idrofobiche nella
zona di attraversamento della membrana e superfici idrofiliche a contatto con l'ambiente e il citoplasma. La
struttura generale della membrana citoplasmatica è stabilizzata da legami idrogeno e da interazioni
idrofobiche. Inoltre, cationi quali Mg2+ e Ca2+ contribuiscono a stabilizzarla grazie a interazioni ioniche
con le cariche negative dei fosfolipidi. Molte proteine della membrana sono localizzate al suo interno e
vengono perciò chiamate proteine integrali di membrana. Altre proteine, possono essere strettamente
associate alla superficie della membrana citoplasmatica e di fatto funzionare come proteine legate alla
membrana e interagiscono con le proteine integrali di membrana in importanti processi cellulari, come il
metabolismo energetico. Alcune di queste proteine associate alla membrana sono lipoproteine e contengono
all'estremità amminoterminale una coda lipidica che  àncora la proteina di membrana stessa. La membrana
citoplasmatica, in realtà, è una struttura piuttosto fluida, in cui i fosfolipidi e le proteine hanno un'elevata
libertà di movimento. Esse possono essere quindi immaginate come un mosaico fluido, nel quale proteine
globulari, orientate in modo specifico, si estendono attraverso uno strato fosfolipidico, altamente mobile, ma
ordinato. Bisogna dire, inoltre, che una delle principali differenze nella composizione chimica tra cellule
eucariotiche e procariotiche è il fatto che le prime possiedono nelle loro membrane steroli, assenti invece
nelle membrane di quasi tutti i procarioti (i batteri metanotrofi e i micoplasmi sono le eccezioni di maggior
rilievo. La presenza di queste molecole nella membrana contribuisce a stabilizzare la struttura e a renderla
meno flessibile. Molecole simili agli steroli chiamate opanoidi sono presenti nella membrana citoplasmatica
di numerosi batteri e possono svolgere una funzione simile a quella degli steroli nelle cellule degli eucarioti.
Il diploptene, un opanoide a 30 atomi di carbonio, è quello più diffuso in natura. A tutt'oggi gli opanoidi non
sono stati trovati negli Archea.
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Biotecnologie microbiche e ambientali 3. I sistemi di trasporto della membrana citoplasmatica
Le proteine di trasporto sono molto di più di semplici veicoli per l'attraversamento della membrana, in
quanto permettono l'accumulo di soluti all'interno della cellula contro un gradiente di concentrazione. Infatti
se la diffusione fosse l'unico meccanismo di trasporto disponibile. All'interno della cellula non si potrebbe
mai stabilire un adeguata concentrazione di soluti per la realizzazione delle reazioni chimiche. A differenza
dei sistemi di diffusione semplice, inoltre, il trasferimento mediato da trasportatori mostra un effetto di
saturazione; se la concentrazione del substrato e sufficientemente elevata da saturare il trasportatore, e
questo normalmente avviene anche a basse concentrazioni di substrato, il tasso di captazione è massimo e la
velocità rimane la medesima anche in caso di un ulteriore aumento della concentrazione del substrato. 
Questa caratteristica è di fondamentale importanza per la cellula, perché le permette di concentrare
all'interno del citoplasma i nutrienti anche quando si trova in un ambiente che ne è particolarmente povero.
Un'altra peculiarità del meccanismo di trasporto mediato è la sua natura altamente specifica. Molte proteine
di trasporto reagiscono con una singola molecola, mentre altre mostrano affinità per un'intera classe di
molecole: ci sono, per esempio, trasportatori che veicolano diversi zuccheri o diversi amminoacidi correlati
tra loro. Inoltre, la sintesi delle proteine di trasporto è regolata dalla cellula, cosicché la presenza di specifici
trasportatori sulla membrana è funzione sia dei nutrienti presenti sia della loro concentrazione nell'ambiente.
Quindi, come ben si può capire, i procarioti hanno evoluto diversi tipi di trasporto, ognuno dei quali con
caratteristiche uniche. Esistono almeno tre classi di sistemi di trasporto della membrana: trasporto semplice,
traslocazione di gruppo e sistema ABC. La prima classe coinvolge soltanto componenti che attraversano lo
spessore della membrana; la seconda classe si avvale di proteine di legame a localizzazione periplasmatica
in aggiunta ai componenti di membrana; il sistema ABC coinvolge una proteina di legame del substrato, un
trasportatore di membrana e una proteina per l'idrolisi del'ATP. Tutti i sistemi sopra descritti richiedono,
comunque, energia nella forma sia di forza proton-motrice ,ATP, sia di altri composti ad alta energia. Dal
punto di vista strutturale, questi trasportatori formano 12  eliche che procedono avanti e indietro nello
spessore della membrana per formare un canale attraverso il quale le sostanze trasportate sono portate
all'interno della cellula. Gli eventi di trasporto implicano dei cambiamenti conformazionali nelle proteine
dovuti al legame con il substrato specifico, grazie ai quali il composto è veicolato attraverso la membrana.
Le diverse tipologie di trasporto sono: le proteine di tipo uniporter trasportano una sostanza
unidirezionalmente da un lato all'altro della membrana; le proteine di tipo symporter trasportano attraverso
la membrana nella stessa direzione una sostanza insieme con un'altra, frequentemente un protone (H+); le
proteine di tipo antiporter trasportano una sostanza in una direzione e un'altra nella direzione opposta.
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Biotecnologie microbiche e ambientali 4. Lac permeasi in Escherichia coli
Un classico esempio di symporter è la Lac permeasi in Escherichia coli. Il primo operone ad essere stato
scoperto è proprio operone Lac in Escherichia coli. Questo operone contiene tre geni che che codificano
quegli enzimi che permettono al batterio di utilizzare lo zucchero lattosio, da cui il nome operone Lac. I tre
enzimi sono: la -galattosidasi (gene lacZ), la lattosio permeasi o galattoside permeasi (lacY) e la galattoside
permeasi (lacA). Il primo enzima trasporta il lattosio all'interno della cellula, il secondo lo scinde nelle due
subunità galattosio e glucosio, mentre la funzione del terzo è ancora poco chiara. Comunque, il prodotto del
gene lacY è la lattosio permeasi un symporter, che trasporta insieme al lattosio, protoni. L'entrata di ioni H+
riduce l'energia della forza proton-motrice che viene poi ristabilita da reazioni che liberano energia e cambia
anche la conformazione della proteina stessa che da E1 a bassa affinità si converte a E2 (lattosio+protone)
per facilitare l'ingresso dello zucchero. Il lattosio viene rapidamente consumato e la diffusione continua.
L'operone Lac risulta essere strettamente correlato. Infatti, intervengono due tipi di controllo. Il primo è un
controllo negativo, che funziona come il freno di una macchina: è necessario lasciare il freno perché la
macchina si muova. Il freno in questione è una proteina chiamata repressore Lac, che è espressa dal gene
LacI, e mantiene l'operone in uno stato spento, fino a quando il lattosio è assente. Se il controllo negativo è
come il freno di una macchina, il controllo positivo è come il pedale dell'acceleratore. Nel caso dell'operone
Lac, la rimozione del repressore dell'operatore non è abbastanza per attivare l'operone. E' necessario un
ulteriore fattore positivo, chiamato attivatore, che risponde a bassi livelli di glucosio stimolando la
trascrizione dell'operone Lac, ma elevati livelli di glucosio mantengono bassa la concentrazione
dell'attivatore impedendo in questo modo la stimolazione della trascrizione dell'operone. Nella traslocazione
di gruppo,invece, una sostanza viene modificata chimicamente durante l'attraversamento della membrana. I
sistemi maggiormente studiati riguardano il trasporto di zuccheri, quali il mannosio, il glucosio e il fruttosio
in Escherichia coli. Questi composti vengono fosforilati durante il trasporto grazie al sistema della
fosfotrasferasi. Questo sistema consiste di una famiglia di proteine, delle quali almeno cinque sono
necessarie per il trasporto di un determinato zucchero. Prima che quest'ultimo venga trasportato all'interno
della cellula, le proteine del sistema fosfotransferasico vengono anch'esse alternativamente fosforilate e
defosforilate con un meccanismo a cascata, finché la proteina integrale di membrana, chiamata Enzima IIc,
non riceve il gruppo fosfato e fosforila a sua volta lo zucchero nell'effettivo processo di trasporto. L'energia
necessaria al sistema fosfotransferasico deriva dal composto ricco di energia fosfoenolpiruvato. Il glucosio
fosforilato a questo punto può essere direttamente assunto in una via metabolica centrale. Il sistema ABC,
invece, coinvolge tre componenti: proteine di legame periplasmatiche (periplasma nei batteri Gram-negativi
spazio tra la membrana citoplasmatica e la membrana esterna), proteine integrali di membrana e proteine per
l'idrolisi dell'ATP (chinasi). Queste ultime forniscono l'energia necessaria. Questi tipi di trasportatori sono
chiamati sistemi di trasporto ABC, dove ABC sta per ATP-binding cassette. Questo sistema di trasporto
esiste per molti nutrienti organici, come gli zuccheri e gli amminoacidi, per una serie di nutrienti inorganici
e per i metalli in traccia. Una delle caratteristiche più interessanti dei sistemi di trasporto ABC è l'elevata
affinità che le proteine di legame periplasmatiche mostrano per il substrato. Queste proteine sono mobili
all'interno del periplasma e sono in grado di legare i loro substrati anche quando questi sono presenti a
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Biotecnologie microbiche e ambientali bassissime concentrazioni. Il substrato, una volta sequestrato dalla proteina di legame, forma un complesso
che agisce con la proteina integrale di membrana e il trasporto avviene grazie all'energia prodotta
dall'idrolisi dell'ATP. Anche se i batteri Gram-positivi, non possiedono un periplasma, questi sistemi di
trasporto sono presenti in molti di questi organismi.
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Biotecnologie microbiche e ambientali 5. La parete cellulare dei procarioti: il peptidoglicano e le molecole
correlate
La concentrazione di soluti all'interno della cellula sviluppa una notevole pressione che viene sopportata
dalla parete cellulare, che conferisce inoltre alla cellula batterica forma e rigidità. Come abbiamo detto, i
batteri possono essere divisi in due gruppi principali, detti Gram-positivi e Gram-negativi, in base alle
differenze che vi sono tra le strutture della parete cellulare e quindi della colorazione. Infatti l'aspetto delle
pareti cellulari dei batteri Gram-negativi è una struttura multistratificata e piuttosto complessa, mentre quella
dei batteri Gram-positivi consiste di un singolo tipo di molecola ed è molto più spessa. Bisogna ricordare
che la parete cellulare è presente in tutti i procarioti ad eccezione dei Micoplasmi e di alcuni Archea
(Thermoplasma e Picrophilus). Nelle pareti cellulari dei Batteri vi è uno strato rigido che è il principale
responsabile della resistenza della parete. Questo strato in entrambi i tipi di batteri, Gram-positivi e Gram-
negativi, ha una composizione chimica simile. Esso è chiamato peptidoglicano e ogni suo strato è una sottile
lamina costituita da due derivati polisaccaridici, l'N-acetilglucosamina e l'acido N-acetilmuramico, e da un
piccolo gruppo di amminoacidi rappresentato da L-alanina, D-alanina, acido D-glutamico e lisina o, in
alternativa, acido diaminopimelico (DAP). Questi costituenti cono assemblati in modo da formare un'unità
di ripetizione, il glican tetrapeptide. Le catene di glicano che formano la lamina sono tenuti insieme da
legami crociati tetrapeptidici tra amminoacidi. I legami glicosidici che uniscono tra loro gli zuccheri delle
catene glicaniche sono molto forti, ma tali catene non sono sufficienti a conferire rigidità alla cellula in tutte
le direzioni. La robustezza propria della struttura peptidoglicana si ottiene soltanto quando queste catene
vengono interlacciate tra loro da amminoacidi mediante legami crociati. La quantità di tali legami varia
specificatamente tra Batteri diversi, inducendo una rigidità tanto più elevata quanto più sono numerosi. Nei
batteri Gram-negativi i legami sono rappresentati generalmente da un legame peptidico diretto tra il gruppo
amminico dell'acido diaminopimelico e il gruppo carbossilico della D-alanina terminale. Nei batteri Gram-
positivi i legami crociati sono costituiti generalmente da un ponte peptidico , e il tipo e il numero di legami
crociati variano in modo caratteristico da un organismo ad un altro. Nei batteri Gram-positivi, inoltre, il
peptidoglicano rappresenta più del 90% della parete cellulare; altri costituenti come gli acidi teicoici sono
presenti in piccole quantità. Nei batteri Gram-negativi, invece, soltanto il 10% circa della parete è costituito
da peptidoglicano, la parte restante è costituita invece dalla membrana esterna. In ogni caso, si pensa che la
lunghezza delle catene di peptidoglicano e la quantità di legami crociati siano responsabili della forma
caratteristica sia nei batteri Gram-positivi sia in quelli Gram-negativi. Il peptidoglicano è presente sono nei
Batteri: sia l'acido N-acetilmuramico sia l'acido diaminopimelico (DAP) sono del tutto assenti nella parete
cellulare degli Archea e degli Eucarioti. Comunque, non tutti i Batteri noti hanno DAP nel peptidoglicano.
Un altro aspetto inusuale del peptidoglicano riguarda la presenza di due amminoacidi in conformazione D,
la D-alanina e l'acido D-glutamico (nelle proteine gli amminoacidi si trovano generalmente nella forma
enantiomerica L). Si conoscono più di 100 differenti tipi di peptidoglicano e la regione maggiormente
variabile è il ponte peptidico. Ogni struttura, nonostante le differenze, presenta la porzione glicanica
uniforme, formata esclusivamente dagli acidi N-acetilglucosamina e N-acetilmuramico legati tra loro da
legami -1,4. Il tetrapeptide delle unità ripetute mostra soltanto variazioni di rilievo in un amminoacido, e
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Biotecnologie microbiche e ambientali cioè l'alternanza tra la lisina e l'acido diaminopimelico. Inoltre in alcuni organismi l'acido D-glutamico in
posizione 2 può trovarsi nella forma idrossilata. Possiamo affermare, comunque, che pur variando la
struttura chimica del peptidoglicano, la struttura generale è la medesima in tutte le molecole: la glucosamina
e l'acido muramico formano lo scheletro, e le molecole di acido muramico sono legate mediante ponti
peptidici tra gli amminoacidi.
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Biotecnologie microbiche e ambientali 6. La membrana esterna dei batteri gram-negativi
Oltre al peptidoglicano , i batteri Gram negativi possiedono uno strato aggiuntivo, chiamato membrana
esterna (ME). Pur trattandosi effettivamente di un doppio strato lipidico, esso non è costituito soltanto da
fosfolipidi e proteine, come la membrana citoplasmatica, ma contiene anche polisaccaridi. I lipidi e i
polisaccaridi sono strettamente legati tra loro a formare un complesso lipopolisaccaridico. A causa della
presenza di questo complesso, la membrana esterna è frequentemente chiamata strato lipopolisaccaridico o
semplicemente LPS. La porzione polisaccaridica consiste di due frazioni, il polisaccaride interno o core
polisaccaridico e il polisaccaride esterno, chiamato anche polisaccaride O. In Salmonella, dove è stato ben
caratterizzato, il core polisaccaridico è costituito da chetodeossioctonato (KDO), zuccheri a sette atomi di
carbonio (eptosi), glucosio, galattosio e N-acetilglucosamina. Il polisaccaride O-specifico, invece, contiene
galattosio, glucosio, ramnosio e mannosio (tutti zuccheri a sei atomi di carbonio), nonché uno o più
dideossizuccheri, quali abequosio, colitosio, paratosio o tivelosio. Questi zuccheri sono legati a formare
catene da quattro o cinque elementi, spesso ramificate. Nella porzione lipidica del lipopolisaccaride, detta
lipide A, gli acidi grassi sono legati tramite un legame estere-amminico a un disaccaride costituito da N-
acetilglucosamina fosfato. Il disaccaride è attaccato al core polisaccaridico attraverso il KDO. Gli acidi
grassi che si trovano più comunemente nel lipide A comprendono gli acidi caproico, laurico, miristico,
palmitico e stearico. Il LPS si associa a varie proteine a formare la metà esterna della membrana. Sul lato
interno della membrana esterna di molti batteri Gram-negativi è presente un complesso lipoproteico. Questa
lipoproteina è una piccola proteina che svolge funzioni di ancoraggio tra membrana esterna e
peptidoglicano. Sul lato interno della membrana esterna sono presenti principalmente fosfolipidi, mentre sul
lato esterno essi vengono sostituiti dal LPS.           
Sebbene la principale funzione della membrana esterna sia ti tipo strutturale, una delle sue importanti
proprietà biologiche è la tossicità per gli animali. Le proprietà tossiche dipendono da una porzione del LPS,
e in particolare del lipide A di questi microrganismi. Per definire questo composto tossico viene
normalmente usato il termine endotossina. Alcune endotossine possono causare gravi sintomi all'uomo come
la febbre che è un sintomo generale dovuto alla stimolazione del rilascio di particolari proteine definite
pirogeni endogeni che colpiscono i centri nervosi deputati al controllo della temperatura corporea. Inoltre
possono indurre uno stato di infiammazione generalizzata che può indurre alla morte. Studi di frazionamento
dell'LPS hanno dimostrato che:  la frazione lipidica è responsabile della tossicità mentre la frazione
polisaccaridica rende il complesso idrosolubile ed immunogenico. Per ottenere un effetto tossico in vivo
sono richieste entrambi le componenti; (per controllare la presenza di endotossine nel siero, nel fluido
cerebrospinale, nei solventi per le preparazioni farmaceutiche si usa il saggio di Limus). A differenza della
membrana citoplasmatica, la membrana esterna dei batteri Gram-negativi, pur essendo essenzialmente un
doppio strato fosfolipidico , è parzialmente permeabile a piccole molecole. Ciò avviene grazie alla presenza
sulla membrana esterna di piccole proteine chiamate porine, che svolgono la funzione di canali permettendo
l'entrata e l'uscita di sostanza idrofiliche, a bassa peso molecolare, attraverso la membrana. Sono state
identificate numerose porine, sia specifiche che aspecifiche: le porine aspecifiche formano canali acquosi,
attraverso i quali possono transitare piccole molecole di ogni tipo, mentre quelle che contengono uno
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Biotecnologie microbiche e ambientali specifico sito di legame per una o più sostanze strettamente correlate sono porine specifiche. Studi strutturali
hanno dimostrato che la maggior parte delle porine sono proteine transmembrana e contengono tre subunità
identiche. Esistono due tipi di porine molto importanti: OmpF e OmpC (outer membrane protein). Se la
pressione osmotica è bassa viene sintetizzata OmpF, una porina dotata di un poro più ampio. Se la pressione
osmotica è più elevata viene sintetizzata, invece, OmpC, una porina con un poro si dimensioni ridotte. Il
regolatore è la proteina OmpR che quando viene fosforilata (OmpR-P) agisce come attivatore del gene
ompC e repressore del gene ompF. Sebbene sia permeabile a piccole molecole, la membrana esterna è
impermeabile a enzimi e a molecole di grandi dimensioni che vanno a localizzarsi in una regione chiamata
periplasma. Questo spazio, situata tra la superficie esterna della membrana citoplasmatica e la superfici
interni della membrana esterna, ha uno spessore di circa 12-15 nm e una consistenza gelatinosa., dovuta
all'abbondanza di proteine periplasmatiche. A seconda dell'organismo, il periplasma può contenere
parecchie proteine, tra cui enzimi idrolitici, che hanno la funzione di avviare la degradazione delle molecole
nutritive, proteine di legame, che innescano i processi di trasporto dei substrati, e i chemiorecettori, proteine
coinvolte nella risposta chemiotattica. Comunque molte di queste proteine raggiungono il periplasma tramite
il sistema di trasporto SecYEG.
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Biotecnologie microbiche e ambientali 7. Le endospore e la sporulazione
Alcune specie di batteri producono speciali strutture all'interno delle loro cellule chiamate endospore
durante un processo definito sporulazione. Le endospore sono cellule differenziate molto resistenti al calore
e che non possono essere distrutte facilmente. La funzione biologica delle endospore è, senza dubbio, quella
di permettere al microrganismo di resistere anche in condizioni avverse quali valori estremi di temperatura e
disidratazione. Le endospore rappresentano poi strutture ideali per la dispersione ad opera del vento e
dell'acqua. I generi Bacillus e Clostridium sono tra i batteri sporigeni più studiati. Le endospore appaiono
chiaramente con il microscopio ottico come strutture fortemente rifrangenti. Esse sono impermeabili ai
coloranti, proprietà che le evidenzia come regioni incolori in cellule trattate con colori basici come il blu di
metilene. La struttura di un endospora appare profondamente diversa di quella di una cellula vegetativa; essa
infatti è molto più complessa, poiché è costituita da numerosi strati di rivestimento (assenti nella cellula
vegetativa). Lo strato più esterno, detto esosporio, è sottile e delicato. All'interno dell'esosporio si trova la
tunica (o parete della spora), che è composta da uno o più strati proteici. Al di sotto del quale si trova la
corteccia, uno strato di peptidoglicano lasso, all'interno del quale è situato il core o protoplasto della spora,
costituito da strutture convenzionali quali parete cellulare, membrana citoplasmatica, citoplasma, nucleoide,
ribosomi e altri costituenti cellulari essenziali. Una sostanza chimica caratteristica delle endospore, assente
nelle cellule vegetative, è l'acido dipicolinico, localizzato a livello del core. Le spore presentano, inoltre,
un'elevata concentrazione di ioni calcio, molti dei quali in un complesso con l'acido dipicolinico. Questo
complesso del core rappresenta il 10%  del peso secco dell'endospora; la funzione di questo complesso è
quella di ridurre la presenza di acqua all'interno dell'endospora, facilitando la disidratazione. Il protoplasto di
un endospora matura è molto diverso dalla cellula vegetativa da cui origina. Esso si trova in uno stadio di
parziale disidratazione durante la sporulazione. Il core di un endospora matura contiene soltanto dal 10 al
25% del contenuto d'acqua della cellula vegetativa, e la sua consistenza appare quindi quella di un denso
gel. Il grado di disidratazione del core aumenta la resistenza al calore dell'endospora, ma è stato anche
osservato che conferisce resistenza ad alcune sostanze chimiche, come il perossido d'idrogeno, e causa la
parziale inattività degli enzimi presenti. Oltre al basso contenuto d'acqua dell'endospora, il pH del core
citoplasmatico è di circa un'unità più basso di quello della cellula vegetativa e contiene una grande quantità
di proteine core-specifiche chiamate small acid-soluble spore proteins (SASP). Queste sono prodotte durante
il processo di sporulazione e le funzioni principali sono: legare fortemente il DNA nel core e proteggerlo dai
potenziali danni delle radiazioni ultraviolette, dall'essiccamento e dal calore. Il conferimento della resistenza
alle radiazioni ultraviolette è dovuto alla modificazione della struttura del DNA dalla forma “B” a quella più
compatta”A”. Inoltre, le SASP funzionano come fonte di carbonio ed energia per la formazione della nuova
cellula vegetativa a partire dall'endospora, un processo chiamato germinazione.  
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Biotecnologie microbiche e ambientali 8. La locomozione microbica
Molte cellule sono provviste di movimento attivo; la motilità permette ad esse di raggiungere zone diverse
all'interno del loro microambiente. Nella lotta per la sopravvivenza, la capacità di raggiungere nuove
posizioni offre alla cellula nuove risorse e opportunità di crescita e segnala differenza tra la vita e la morte.
Questa capacità di muoversi automaticamente dipende in genere da una particolare struttura, il flagello. I
flagelli batterici sono appendici cellulari lunghi e sottili, libere a un'estremità e intimamente legate alla
cellula all'altra estremità. Essi sono così sottili (circa 20nm) che un singolo flagello non può essere
visualizzato al microscopio ottico se non dopo colorazione con coloranti specifici che ne aumentano il
diametro. Sono invece facilmente visibili al microscopio elettronico. I flagelli sono disposti in modo diverso
nei diversi batteri. Nella distribuzione polare sono attaccati ad uno o ad entrambi i poli della cellula. Talvolta
un ciuffo di flagelli può originarsi a un'estremità della cellula, disposizione detta lofotrica. Nella
distribuzione peritrica, invece, i flagelli si originano da numerosi punti della superficie della cellula.
Comunque il filamento dei flagelli batterici è costituito da numerose subunità di flagellina. Il flagello
consiste di diverse parti e funziona mediante rotazione, paragonabile quindi alla propulsione determinata da
un motore in una barca. La regione basale del flagello ha una struttura diversa da quella del filamento. Essa
è costituita da una regione più ampia, chiamata uncino, formata da un singolo tipo di proteina e con la
funzione di connettere il filamento alla porzione del motore del flagello. Il motore flagellare, ancorato alla
membrana citoplasmatica e alla parete cellulare, è formato da una piccola regione bastoncellare centrale che
passa attraverso un sistema di anelli. Nei batteri Gram-negativi un anello esterno, chiamato anello L, è
ancorato allo strato lipopolisaccaridico, mentre un secondo anello, chiamato anello P, è ancorato al
peptidoglicano della parete cellulare. Un terzo gruppo di anelli, chiamati anelli MS e C, sono localizzati,
rispettivamente, all'interno della membrana citoplasmatica e del citoplasma. Nei batteri Gram-positivi, che
sono primi dello strato lipopolisaccaridico esterno, è presente solo la coppia più interna. Intorno ad essa, e
ancorate alla membrana citoplasmatica, sono localizzate delle proteine chiamate Mot. Queste proteine
controllano il motore, che con una torsione fa ruotare il filamento. Un altro gruppo di proteine dette Fil,
funge da invertitore, ribaltando la rotazione del flagello in risposta a segnali intracellulari. Il motore di
rotazione contiene due componenti: il rotatore e lo statore. Nel motore flagellare, il rotore consiste degli
anelli C, MS e P e, nel loro insieme questi anelli costituiscono il corpo basale. Lo statore è invece costituito
dalle proteine Mot che circondano gli anelli MS e C. Si ritiene che il movimento rotatorio del flagello sia
impartito dal corpo basale. L'energia richiesta per la rotazione del flagello proviene dalla forza proton-
motrice, ed è stato calcolato che devono essere traslocati circa 1000 protoni affinché possa avvenire un
singolo movimento rotatorio. I dati sperimentali in nostro possesso hanno consentito di proporre un modello
a “turbina protonica”. In questo modello, il flusso dei protoni attraverso il canale dello statore esercita una
forza elettrostatica sulle cariche disposte elicoidalmente sulle proteine del rotore. L'attrazione tra cariche
positive e negative causa la rotazione del corpo basale in risposta al flusso protonico all'interno dello statore.
Domenico Azarnia Tehran Sezione Appunti
Biotecnologie microbiche e ambientali 9. Organizzazione del DNA nelle cellule
I processi vitali delle cellule sono governati dal loro contenuto genetico, e l'insieme dei loro geni è detto
genoma. Quest'ultimo è organizzato in modo diverso a seconda se si tratti di procarioti o di eucarioti. Nelle
cellule procariotiche il DNA è presente in genere sotto forma di una grande molecola a doppio filamento
chiamata cromosoma batterico. Il cromosoma è aggregato a formare una massa visibilmente densa definita
nucleoide. La maggior parte dei procarioti ha un cromosoma singolo e il DNA è circolare. Per questo
motivo, essi tipicamente contengono una singola copia di ogni gene e sono quindi geneticamente aploidi. La
maggior parte dei procarioti possiede inoltre una certa quantità di DNA extracromosomico, ancora una volta
organizzato in molecole circolari, chiamate plasmidi. Quest'ultimi contengono generalmente geni che
conferiscono alla cellula proprietà speciali. Negli eucarioti il DNA, invece, è presente come molecola lineare
all'interno del nucleo, impacchettato e organizzato in uno stato fortemente strutturato in modo da costruire
degli elementi chiamati cromosomi, il cui numero varia nei diversi organismi. I cromosomi oltre al DNA
contengono anche proteine e gli eucarioti possiedono due copie di ogni gene e sono quindi diploidi.
Domenico Azarnia Tehran Sezione Appunti
Biotecnologie microbiche e ambientali